蛋白-RNA复合物Pull-Down试剂盒(生物素-SA磁珠法)

产品货号：

KL241211

中文名称：

英文名称：

Protein-RNA Pull-Down Kit(Biotin-SA Magnetic Bead)

产品规格：

30T

发货周期：

1～3天

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本制品是基于生物素-SA磁珠法开发的蛋白质-RNA复合物的Pull-Down试剂盒，提供试剂足够进行30次蛋白质-RNA复合物的Pull-Down实验。

保存：-20℃，有效期1年。

用户自备

PBS、RNase-free水、生物素标记的RNA探针、生物素RNA标记混合物、磁力架、混匀仪、低温离心机、超声波破碎仪、离心管。

一、探针的制备

根据目标RNA序列设计带有T7启动子（TAATACGACTCACTATAGGG）的引物，以目标序列的DNA质粒为模板，PCR分别获得T7-正义RNA（实验组）和T7-反义RNA（对照组）转录模板，按照DNA凝胶回收试剂盒说明书要求回收纯化目标DNA。

引物名称	引物序列
正义链-正引物(带T7启动子)	5'-TAATACGACTCACTATAGGG+目标RNA头部序列-3'
正义链-反引物	5'-目标RNA尾部序列的反向互作序列-3'
反义链-正引物	5'-目标RNA头部序列-3’
反义链-反引物(带T7启动子)	5'-TAATACGACTCACTATAGGG+目标RNA尾部序列的反向互作序列-3'

以上述DNA为模板，按照自备的RNA体外转录试剂盒说明书配制反应体系。
为了避免转录产物中的游离生物素UTP竞争结合磁珠，此处最好采用RNA纯化试剂盒来处理转录产物，但此操作可能造成一定的产物损失，可以根据具体情况决定是否进行此步操作。
取2μL RNA检测浓度，取1～2μL RNA进行2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量和长度；符合要求的RNA置于- 80℃保存或直接用于后续实验。
由于RNA容易降解，最好在实验当天或前一天进行体外转录实验。

二、动物细胞样本裂解

实验组和对照组一共取2×10⁷～4×10⁷个细胞，用预冷的PBS（RNase-free）清洗细胞2～3次，每次4℃ 500×g离心5min收集沉淀，去除培养基成分。
将样本置于冰上，加入0.6mL预冷的Pull-Down专用裂解液、6μL Pull-Down专用蛋白酶抑制剂和3μL Pull-Down专用RNase抑制剂，吹打混匀。
为了更充分裂解，最好冰上超声至溶液基本澄清，如果无超声条件，也可以置于冰上裂解30min，间隔手动混匀。
4℃ 12000×g离心15min，收集上清至新的无RNase离心管中。
取30μL作为input，剩余上清平分为两份用于RNA pull-down实验，置于冰上备用或-80℃保存。

三、动物组织样本裂解

采用预冷的PBS(RNase-free)清洗新鲜组织2～3次，彻底去除血液等成分；如果样本为冷冻组织，在取样时也需要进行清洗操作。
实验组和对照组共取0.2～0.4g干净组织，用液氮在研钵中充分研磨，转移粉末至预冷的、新的无RNase离心管中。
同7～9步。
- 当样本不能完全裂解时（溶液很浑浊），可以增加裂解缓冲液或改善超声条件继续裂解。
- 超声条件因样本类型和超声设备而异，应提前摸索好合适的条件。
- 如果样本中目标蛋白或RNA丰度较低，或结合物间的结合较弱，可以增加初始样本量，同时等比例增加裂解缓冲液和酶抑制剂的用量，但总孵育体积最大不超过离心管体积的2/3，体积过大可以更换大规格离心管。

四、磁珠准备

五、漂洗液准备

为了防止实验过程中的蛋白和RNA降解，需要向漂洗液中添加蛋白酶抑制剂和RNase抑制剂。在10mL离心管中加入实验组和对照组总共所需的5mL Pull-Down专用洗涤液、25μL Pull-Down专用蛋白酶抑制剂和2.5μL Pull-Down专用RNase抑制剂，混合均匀，冰上保存，现配现用。
如果有多组样本，请按照实际使用量配制。

六、RNA pull-down

取实验组和对照组RNA探针各3μg，95℃变性3min，冰浴1min，短暂离心甩下管壁液体，向管中加入50μL Pull-Down专用RNA折叠缓冲液，室温放置30min。
将RNA探针分别加入对应步骤四制备的磁珠中，混匀仪上室温孵育30min。
放磁力架上静置1min并弃上清。
每组加入500μL步骤五准备的漂洗液，颠倒混匀30次，放磁力架上静置1min并弃上清。
重复上步操作一次。
加入相应组别的样本裂解液，混匀仪上4℃孵育2~4h。
放磁力架上静置1min并弃上清。
每组加入500μL漂洗液，颠倒混匀30次，放磁力架上静置1min弃上清。
重复上步漂洗操作两次，共漂洗三次，保留磁珠。

七、蛋白洗脱

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